**培养条件**

气相与温度

培养条件为95%空气与5%二氧化碳的气相，温度保持在37℃。

传代方法

首次传代建议比例为1:2。在传代过程中，建议每两天更换培养液。为了确保细胞健康，建议购买完成培养所需的所有材料，这样能够享受额外的优惠。

收到细胞后，处理时需确保状态良好，充满完全培养液后将瓶口封好，这是运输细胞的最佳方法。细胞运输后，应使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以使细胞状态稳定后再进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片以保存记录（最好在40x、100x、200x下各拍摄一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，若不提供照片，视为收到状态良好。

细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞未超过80%的汇合度，收集瓶内完全培养液至离心管中，留5ml完全培养基置于37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，可直接进行传代。

贴壁细胞传代的步骤如下：

1. 丢弃培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况；当大部分细胞变圆并脱落时，迅速取回操作台，轻击培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中， centrifuge 1000 RPM， 5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶培养（分为两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察并待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液停止消化，轻柔吹打后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接置于-80℃冰箱中，若后期需存放入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放超过24小时后再转入液氮罐中。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管时需佩戴防护面具，快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶后，使用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬并接种至T25培养瓶，放于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天，更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

某些细胞可能在运输过程中容易脱落，这属于正常现象。如脱落细胞较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。沉淀细胞后添加1-2ml胰酶，轻巧吹打，重悬并消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止消化。再进行离心，弃去上清，补充1-2ml完全培养基重悬。最后按照1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

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